黄芪甲苷的测定

黄芪甲苷的测定(HPLC-ELSD法)
1.范围
本标准适用于测定黄芪(Astragalus Root, RADIX ASTRAGALI,A.membranaceus(Fisch.)Bge豆科)中黄芪甲苷(astragaloside)的含量。

2.原理
黄芪甲苷在紫外区吸收差(它的 吸收波长为200.8nm),改用ELSD后,所用的流动相全部蒸发,不干扰测定,因此灵敏度高,而稳定性及重现性均符合测定要求。
3.试剂
3.1 重蒸水
3.2 乙腈(色谱纯)
3.3 甲醇(分析纯)
3.4 黄芪甲苷标准品(astragaloside Ⅳ,C41H68O14)

4. 仪器
4.1 高效液相色谱仪(配色谱工作站)
4.2 分析天平(1/10000)
4.3 超声波清洗仪
4.4 0.45 m 微孔过滤器
4.5 ELSD检测仪(Alltech 2000)
4.6容量瓶
4.7带塞小玻璃瓶
4.8 色谱柱 Shimpack VP-ODS C18 5 m 4.6150mm
5.分析步骤
5.1黄芪甲甙标准品储备溶液:称取10mg黄芪甲甙标准品置于50ml的容量瓶中,用甲醇溶解,超声冷却定容,0.45 m微孔滤膜过滤,于冰箱中保存。
5.2黄芪甲甙标准品供试液:取黄芪甲甙标准储备溶液0.0、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0、10.0ml置于10ml的容量瓶中,用水稀释到刻度,摇匀,即为供试液。
5.3 待测样品供试液
5.3.1精确称取50mg提取物于50ml容量瓶中,用甲醇超声溶解,冷却定容,0.45 m微孔滤膜过滤为供试液。
5.3.2精密称取本品粗粉约1.5g,置索氏提取器中,加甲醇40ml,冷浸过夜,再加甲醇适量,回流4h,提取液回收甲醇并浓缩至干,残渣加水10ml,微热使溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇提取液,用氨试液提取2次,每次20ml,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水3-5ml使溶解,放冷,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm,长12cm),以水50ml洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30ml洗脱,弃去洗脱液,继用70%乙醇50ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并定容至2ml,摇匀,即得供试品溶液。
5.3.3供试样品溶液的制备:精密称取黄芪药材粉末2g,加2%的氢氧化钠甲醇溶液30ml,回流提取3次,每次1h。合并提取液,放置在水浴上蒸干,残渣加水30毫升溶解,转移至分液漏斗中,加氯仿——正丁醇(2:1)振摇提取4次。每次20ml;合并提取液,蒸干,残渣用甲醇转移至5毫升容量瓶中。
5.4 色谱条件
5.4.1 流动相 A:水 B:乙腈
A : B = 66 : 34 ( V / V ,等梯度)
流速 1.0ml/min
漂移管温度: 100℃
气体流速: 2.7L/min
进样量: 10l
柱温: 30℃(见图)
5.4.2流动相 甲醇—水(75:25)
流速 1.0ml/min
漂移管温度: 75℃
气体流速: 2.0L/min
进样量: 10l
柱温: 30℃ (见图1)
5.5 线性范围
分别精确吸取上述对照品溶液5.0、10.0、15.0、20.0、25.0ul注入液相色谱仪中,以峰面积的自然对数为横坐标,以浓度的自然对数为纵坐标,作图,线性回归方程为:Y=0.731X—4.13;线性范围为1.0——5.0mg,相关系数r=0.9996。
5.6 样品的测定:
精确吸取待测样品供试液10l,注入液相色谱仪,得出峰面积。将峰面积及浓度均取自然对数后,用外标法计算,求出供试品浓度的自然对数,再转换成供试品的含量。
5.7 计算:
将样品的峰面积的自然对数带入线性回归方程Y=aX+b
其中: Y 为峰面积的自然对数
X 为进样量(g)的自然对数
a 为线性方程的斜率
b 为线性方程的截距